L'hybridation des acides nucléiques est le processus par lequel deux chaînes simples d'ADN ou d'ARN (monocaténaire) provenant de sources biologiques différentes, forment une configuration en double caténaire, sur la base de l'homologie de séquence contingente des deux sources, ce qui donne des hybrides ADN-ADN, ARN-ARN ou ADN-ARN. Dans la technique de génétique moléculaire de l'hybridation de l'ADN, on permet à des brins simples d'ADN provenant de deux espèces différentes de s'assembler pour former des doubles hélices hybrides.

Ces segments hybrides d'ADN peuvent être utilisés pour déterminer la parenté évolutive des organismes en examinant le degré de similitude ou de dissemblance des séquences de paires de bases d'ADN. La technique d'hybridation de l'ADN repose sur deux principes : le premier est que les doubles brins d'ADN sont maintenus ensemble par des liaisons hydrogène entre les paires de bases complémentaires, et le second est que plus deux espèces sont étroitement apparentées, plus le nombre de paires de bases complémentaires dans l'ADN hybride sera élevé.

En d'autres termes, le degré d'hybridation est proportionnel au degré de similitude entre les molécules d'ADN des deux espèces. .